应用CRISPR技术构建基因突变细胞模型实验分析与计划

　　CRISPR/Cas9是一种由RNA指导，利用Cas9内切酶对靶向基因进行编辑的技术。其技术原理是利用Cas9内切酶家族来靶标和剪切外源DNA的Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系统来进行有效的靶向酶切。Cas9内切酶在向导RNA（guide RNA）分子的引导下对特定位点的DNA进行切割，造成DNA双链断裂（DSB,double strand break），这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括非同源末端连接和同源重组修复两种途径。

　　gRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切，这是因为gRNA分子含有与靶DNA序列互补的序列，称之为PAM序列。gRNA的设计和选择是CRISPR技术的核心技术环节，是实验能否成功的关键一步。

　　市健研中心实验室在一个高度近视家系中发现的3种突变，应用CRISPR/Cas9技术对人眼底视网膜色素细胞基因组进行编辑，实现定点突变，构建含有相关突变位点的细胞模型，研究其相关功能。但其中一个位点一直没有筛选到含定点突变的细胞，我们对该突变位点前后500bp序列按124bp，249bp，374bp和499bp的大小梯度进行全基因组blast，检查该段序列在整个基因组上的同源性，进而预估gRNA设计是否能够避开这些位置，减少脱靶的可能性。

　　由查询结果发现突变位点周边序列在整个基因组上的同源性极高，这对gRNA的设计十分不利，因为PAM必须是NGG序列，限制了gRNA的设计位置，而设计的gRNA如果同源性太高容易产生脱靶现象。

　　通过相关文献查阅和序列比对，市健研中心实验室采用不同的修复模板，尝试提高点突变敲入的成功率。目前设计了以下两种方案，方案一：提供特异的寡聚核苷酸链（ssODN）作为修复模板；方案二：扩大编辑范围，采用打靶载体作为修复模板。

　　以上两种方案同时进行实验，其中方案1采用ssODN作为修复模板筛选出的细胞存在目的基因突变，但有部分序列缺失（如图1所示）。

图1 ssODN 修复模板筛选结果

　　方案2通过扩大编辑范围，采用打靶载体作为修复模板，筛选出存在目的基因突变细胞，但却存在2次重复序列（如图2所示）。

图2 打靶载体修复模板筛选结果

　　结果显示我们设计的两种方案均能筛选出含目的突变细胞，虽都存在周边序列缺失或重复的问题。实验结果证实以上方案均可行。下一步将通过扩大筛选细胞数目，进一步优化实验操作方案以增加成功率，争取早日获取目的突变细胞模型。

　　市健研中心分子医学实验室 苏进娣